空氣、食品接觸面（餐具，飲具，器皿表面）微生物檢驗方法、檢驗標(biāo)準(zhǔn)

空氣、食品接觸面微生物檢驗方法、檢驗標(biāo)準(zhǔn)

目的：

檢測生產(chǎn)車間空氣、操作人員手部、與食品有直接接觸面的機械設(shè)備的微生物指標(biāo)，生產(chǎn)區(qū)域環(huán)境當(dāng)中病原微生物的監(jiān)控，達到規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)，以控制食品成品的質(zhì)量。

 
參照標(biāo)準(zhǔn)：

中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)《一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》GB15979－1995、《HACCP原理與實施》、中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)《公共場所空氣微生物檢驗方法細菌總數(shù)測定》GB/T 18204.1－2000、中華人民共和國進出口商品檢驗行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN 0169-92/SN 0172-92/ SN 0170-92、 出入境檢驗檢疫局二000四年《出入食品微生物檢驗培訓(xùn)教材》中《出入食品生產(chǎn)廠衛(wèi)生細菌檢驗方法》、日本東京冷凍食品檢驗方法。

 
采樣與檢測方法：

3.1空氣的采樣與測試方法
 3.1.1樣品采集：
 (1)取樣頻率：
 a)車間轉(zhuǎn)換不同衛(wèi)生要求的產(chǎn)品時，在加工前進行采樣，以便了解車間衛(wèi)生清掃消毒情況。
 b)全廠統(tǒng)一放長假后，車間生產(chǎn)前，進行采樣。
 c)產(chǎn)品檢驗結(jié)果超內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)時，應(yīng)及時對車間進行采樣，如有檢驗不合格點，整改后再進行采樣檢驗。
 d)實驗性新產(chǎn)品，按客戶規(guī)定頻率采樣檢驗。
 e)正常生產(chǎn)狀態(tài)的采樣，每周一次。
 （2）采樣方法
 在動態(tài)下進行，室內(nèi)面積不超過30 m2，在對角線上設(shè)里、中、外三點，里、外點位置距墻1 m；室內(nèi)面積超過30 m2，設(shè)東、西、南、北、中五點，周圍4點距墻1 m。采樣時，將含平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基的平板(直徑9 cm)置采樣點(約桌面高度)，并避開空調(diào)、門窗等空氣流通處，打開平皿蓋，使平板在空氣中暴露5 min。采樣后必須盡快對樣品進行相應(yīng)指標(biāo)的檢測，送檢時間不得超過6h，若樣品保存于0～4℃條件時，送檢時間不得超過24h。
 3.1.2菌落培養(yǎng)：
 （1）在采樣前將準(zhǔn)備好的平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基平板置37℃±1℃ 培養(yǎng)24 h，取出檢查有無污染，將污染培養(yǎng)基剔除。
 （2）將已采集樣品的培養(yǎng)基在6 h內(nèi)送實驗室，細菌總數(shù)于37℃±1℃培養(yǎng)48h觀察結(jié)果，計數(shù)平板上細菌菌落數(shù)。
 （3）菌落計算：
 a) 記錄平均菌落數(shù)，用“個/皿"來報告結(jié)果。用肉眼直接計數(shù)，標(biāo)記或在菌落計數(shù)器上點計，然后用5～10倍放大鏡檢查，不可遺漏。
 b) 若培養(yǎng)皿上有2個或2個以上的菌落重疊，可分辨時仍以2 個或2個以上菌落計數(shù)。
 3.2工作臺（機械器具）表面與工人手表面采樣與測試方法：
 3.2.1樣品采集：
 (1)取樣頻率：
 a)車間轉(zhuǎn)換不同衛(wèi)生要求的產(chǎn)品時，在加工前進行擦拭檢驗，以便了解車間衛(wèi)生清掃消毒情況。
 b)全廠統(tǒng)一放長假后，車間生產(chǎn)前，進行全面擦拭檢驗。
 c)產(chǎn)品檢驗結(jié)果超內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)時，應(yīng)及時對車間可疑處進行擦拭，如有檢驗不合格點，整改后再進行擦拭檢驗。
 d)實驗新產(chǎn)品，按客戶規(guī)定擦拭頻率擦拭檢驗。
 e)對工作表面消毒產(chǎn)生懷疑時，進行擦拭檢驗。
 f)正常生產(chǎn)狀態(tài)的擦拭，每周一次。
 （2） 采樣方法：
  a) 工作臺（機械器具）：用浸有滅菌生理鹽水的棉簽在被檢物體表面（取與食品直接接觸或有一定影響的表面）取25cm2的面積，在其內(nèi)涂抹10次，然后剪去手接觸部分棉棒，將棉簽放入含10mL滅菌生理鹽水的采樣管內(nèi)送檢。
 b) 工人手：被檢人五指并攏，用浸濕生理鹽水的棉簽在右手指曲面，從指尖到指端來回涂擦10次，然后剪去手接觸部分棉棒，將棉簽放入含10mL滅菌生理鹽水的采樣管內(nèi)送檢。
 （3）采樣注意事項：
 擦拭時棉簽要隨時轉(zhuǎn)動，保證擦拭的準(zhǔn)確性。對每個擦拭點應(yīng)詳細記錄所在分場的具體位置、擦拭時間及所擦拭環(huán)節(jié)的消毒時間
 3.2.2細菌·大腸菌群的檢測培養(yǎng):
 樣液稀釋：將放有棉棒的試管充分振搖。此液為1：10稀釋液。如污染嚴(yán)重，可十倍遞增稀釋，吸取1ml 1：10樣液加9ml無菌生理鹽水中，混勻，此液為1：100稀釋液。
 3.2.2.1 細菌總數(shù)：
 （1）以無菌操作，選擇1～2個稀釋度各取1ml樣液分別注入到無菌平皿內(nèi)，每個稀釋度做兩個平皿（平行樣），將已融化冷至45℃左右的平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基傾入平皿，每皿約15ml，充分混合。
 （2）待瓊脂凝固后，將平皿翻轉(zhuǎn)，置36℃±1℃ 培養(yǎng)48 h后計數(shù)。
 （3）結(jié)果報告：報告每25cm2食品接觸面中或每只手的菌落數(shù)
 3.2.2.2大腸菌群：
 （1）平板法:
 a) 以無菌操作，選擇1～2個稀釋度各取1ml樣液分別注入到無菌平皿內(nèi)，每個稀釋度做兩個平皿（平行樣），將已融化冷至45℃左右的去氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基傾入平皿，每皿約15ml，充分混合。待瓊脂凝固后,再覆蓋一層培養(yǎng)基，約3-5 ml。
 b) 待瓊脂凝固后，將平皿翻轉(zhuǎn)，置36℃±1℃ 培養(yǎng)24h后計數(shù)。
 c) 結(jié)果計算： 以平板上出現(xiàn)紫紅色菌落的個數(shù)乘以稀釋倍數(shù)得出。
 d) 結(jié)果報告：報告每25cm2食品接觸面中或每只手的菌落數(shù)
 （2）試管法:
 a) 以無菌操作，選擇3個稀釋度各取1ml樣液分別接種到BGLB肉湯培養(yǎng)基中，每個稀釋度接種三管。
 b) 置BGLB肉湯管于36℃±1℃培養(yǎng)48±2h。記錄所有BGLB肉湯管的產(chǎn)氣管數(shù)。
 c) 結(jié)果報告：按BGLB肉湯管產(chǎn)氣管數(shù)，查MPN表報告每25cm2食品接觸面中或每只手的大腸菌群值。
 3.2.3金黃色葡萄球菌檢測
 （1）定性檢測
 a)  取1ml稀釋液注入滅菌的平皿內(nèi)，傾注15-20ml的B-P培養(yǎng)基，（或是吸取0.1稀釋液，用L棒涂布于表面干燥的B-P瓊脂平板），放進36±1℃的恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)48±2小時。
 b) 從每個平板上至少挑取1個可疑金黃色葡萄球菌的菌落作血漿凝固酶實驗。
 c)  結(jié)果報告：B-P瓊脂平板的可疑菌落作血漿凝固酶實驗為陽性，即報告手（工器具）上有金黃色葡萄球菌存在。
 （2）定量檢測
 a)  以無菌操作，選擇3個稀釋度各取1ml樣液分別接種到含10﹪氯化鈉胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基中，每個稀釋度接種三管。
 b)  置肉湯管于36±1℃的恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)48小時。劃線接種于表面干燥的B-P瓊脂平板，置36℃±1℃ 培養(yǎng)45～48小時。
 c)  從B-P瓊脂平板上，挑取典型或可疑金黃色葡萄球菌菌落接種肉湯培養(yǎng)基，36℃±1℃培養(yǎng)20～24小時。
 d)  取肉湯培養(yǎng)物做血漿凝固酶試驗，記錄試驗結(jié)果。
 e)  報告結(jié)果：根據(jù)凝固酶試驗結(jié)果，查MPN表報告每25 cm2食品接觸面中或每只手的金黃色葡萄球菌值。
 3.3工廠環(huán)境中病原體的檢測計劃與方法
 檢測計劃：為了保證食品安全，工廠應(yīng)該對生產(chǎn)環(huán)境中的病原微生物進行檢測和評估，檢測項目包括李斯特菌，沙門氏菌等病原體微生物，化驗室應(yīng)該按照一定的計劃對生產(chǎn)場所環(huán)境中的病原體進行檢測，其中包括地面、下水道、排水溝、墻壁、天花板、設(shè)備框架、運輸?shù)闹Ъ?，冷藏裝置、速凍機、傳送帶、設(shè)備的螺絲、維修工具等部位。當(dāng)某個點檢測到病員微生物時，應(yīng)該對環(huán)境中的相似點加大檢測頻率；在把所有的預(yù)定點檢測完后，應(yīng)該對環(huán)境中的病原微生物的存在狀況進行全面評估，在下一次環(huán)境檢測循環(huán)過程中加強檢測容易出現(xiàn)病原體的環(huán)境點，達到持續(xù)改進的目的。
 檢測頻率: 每月兩次,每次每個區(qū)域至少選取5個檢測點,分別進行檢測。
 3.3.1環(huán)境李斯特菌的檢測方法（3MTM  PetrifilmTM 環(huán)境李斯特菌的測試片）
 3.3.1.1 用涂抹棒，海綿或者其他采樣設(shè)備收集環(huán)境樣本。
 3.3.1.2 將收集的樣本添加10毫升滅菌的緩沖蛋白胨水，將樣本與緩沖蛋白胨混合1分鐘，將樣品置于室溫（20-30℃）1小時，最久不超過1.5小時，以修復(fù)損傷的李斯特菌。
 3.3.1.3 將測試片放在平坦處，掀起上層膜。
 3.3.1.4 用移液器垂直滴加3毫升樣品到下層膜中央，將上層膜緩慢蓋下，以免產(chǎn)生氣泡。
 3.3.1.5 輕輕將塑料壓板放在位于接種區(qū)上層膜上，不要壓，扭轉(zhuǎn)或者滑動壓板。提起壓板等至少十分鐘，以使膠體凝固。
 3.3.1.6 將測試片透明面朝上，可疊放至十片，在37℃±1℃培養(yǎng)26-30小時，可以用標(biāo)準(zhǔn)菌落記數(shù)器或者其他光學(xué)放大器判讀，不要記數(shù)圓形輪廓上的菌落，因為他們不受選擇性培養(yǎng)基的影響。
 3.3.1.7 對于定性檢測，根據(jù)紫紅色菌落是否存在，結(jié)果記為檢出或者未檢出。
 3.3.2環(huán)境中沙門氏菌的檢測方法
 3.3.2.1采樣地點: 選取采樣點時因盡量選取微生物容易滋生的地方

3.3.2.2 操作步驟
3.3.2.2.1采樣應(yīng)在生產(chǎn)開始后進行，用已浸潤過的棉拭在選定的被測表面旋轉(zhuǎn)涂抹約100cm2的面積，然后將棉拭放回涂抹試管并蓋緊。        
3.3.2.2.2將樣品帶回實驗室，每5個點混合成一個樣品, 登記編號,按照SN0170-92標(biāo)準(zhǔn)及時檢測，若有陽性結(jié)果出現(xiàn)，應(yīng)逐步對所混合的每個點分別檢測。 
物體表面涂抹菌落總數(shù)計算方式：物體表面細菌總數(shù)（cfu/c㎡）=平皿上菌落的平均數(shù)*采樣液稀釋倍數(shù)/采樣面積（cm2）
根椐GB15979－2002《一次性衛(wèi)生用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》的標(biāo)準(zhǔn),生產(chǎn)環(huán)境衛(wèi)生指標(biāo)
1 裝配與包裝車間空氣中細菌菌落總數(shù)應(yīng)≤2 500 cfu/m3。
2 工作臺表面細菌菌落總數(shù)應(yīng)≤20 cfu/cm2。
3. 工人手表面細菌菌落總數(shù)應(yīng)≤300 cfu/只手，并不得檢出致病菌。
人員和環(huán)境衛(wèi)生檢測方法
一、        空氣采樣及檢驗方法
1培養(yǎng)基：普通營養(yǎng)瓊脂平板，按GB4789.28中3.7條配制
2采樣（空氣沉降法）
2.1布點：面積小于30平方米的車間，設(shè)一對角線，在線上取3點，即中心一點，兩端在距墻1米處各取一點；面積大于30平方米的車間，設(shè)東、西、南、北、中5個點，其中東、西、南、北點均距墻1米。
2.2采樣高度：與地面垂直高度80-150厘米。
2.3采樣方法；用直徑為9厘米的普通營養(yǎng)瓊脂平板在采樣點上暴露20分鐘蓋上送檢培養(yǎng)。
3培養(yǎng)：于37℃培養(yǎng)24小時。
4檢測頻率：每周
空氣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：
生車間、熟車間、成品車間：低于100個
半成品庫、成品庫：低于10個
二、設(shè)備的采樣與檢驗方法
根據(jù)生產(chǎn)過程所要求的重點衛(wèi)生部位，實驗室對其進行涂抹采樣，進行細菌總數(shù)檢驗。
1采樣方法
1.1涂抹法（適用于表面平坦的設(shè)備和工器具產(chǎn)品接觸面）
取經(jīng)過滅菌的鋁片框（框內(nèi)面積為50平方厘米）放在需檢查的部位上，用無菌棉球蘸上無菌生理鹽水擦拭鋁片中間方框部分，擦完后立即將棉球投入盛有10毫升無菌生理鹽水的試管中，此液每毫升代表5平方厘米。
1.2貼紙法（適用于表面不平坦的設(shè)備和工器具接處面）
將無菌規(guī)格紙（5×5厘米，紙質(zhì)要薄而軟）用無菌生理鹽水泡濕后，于需測部分分別貼上兩張，兩張紙面積共50平方厘米，然后取下放入盛有10毫升無菌生理鹽水的試管中，此液每毫升代表5平方厘米。
2檢驗方法
2.1細菌總數(shù)的檢驗
將上述樣液充分振搖，根據(jù)衛(wèi)生情況，相應(yīng)地做10倍遞增稀釋，選擇其中2-3個合適的稀釋度作平皿傾注培養(yǎng)，培養(yǎng)基用普通營養(yǎng)瓊脂，每個稀釋度作2個平皿，每個平皿注入1毫升樣液，于37℃培養(yǎng)24小時后計菌落數(shù)。
結(jié)果計算
表面細菌總數(shù)（cfu/cm2）=平皿上菌落的平均數(shù)×樣液稀釋倍數(shù)/30×2
2.2致病菌的檢驗
沙門氏菌，參照GB4789.4進行
金黃色葡球菌，參照GB7918.5進行
4.檢驗合格標(biāo)準(zhǔn)：細菌總數(shù)10－100個∕cm2，
5.關(guān)鍵點：細菌總數(shù)≤10個∕cm2
一般區(qū)域：細菌總數(shù)≤100個∕cm2
三、人員手表面細菌污染情況的檢驗
1.        采樣方法：用一支蘸有無菌生理鹽水的棉拭子涂擦被檢對象手的全部，反復(fù)兩次，涂擦的時候棉拭子要相應(yīng)地轉(zhuǎn)動，擦完后，將手接觸部分剪去，將棉拭子放入裝有10毫升無菌生理鹽水的試管內(nèi)送檢培養(yǎng)。
2.        檢驗方法：同工器具表面細菌總數(shù)檢驗方法。
3.        結(jié)果計算：每只手表面的細菌總數(shù)（cfu/只手）=平皿上菌落的平均數(shù)× 樣液稀釋倍數(shù)
四、消毒液藥效的微生物學(xué)鑒定法
1采樣對象：正常使用的消毒液，和已知配制好備用的消毒液
2采樣及檢驗方法
在無菌條件下，用無菌吸管吸取1毫升樣液，加入9毫升稀釋液中混勻，對于醇類與酚類消毒劑，稀釋液用普通營養(yǎng)肉湯即可；對于含氯消毒劑、含碘消毒劑，需在肉湯中加入0.1%硫代硫酸鈉，對洗必泰、季銨鹽類消毒劑，需在肉湯中加入3%（W/V）土溫80和0.3%卵磷脂；對醛類消毒劑，需在肉湯中加入0.3%甘氨酸；對于含有表面活性劑的各種復(fù)方消毒劑，需在肉湯中加入（W/V）土溫80，以中和被檢樣液中的殘效作用，
將注入了樣液的稀釋液充分搖勻，取1毫升注入平皿，隨之倒入普通營養(yǎng)瓊脂，待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，將平皿于37℃條件下培養(yǎng)24小時后計平板上生長的菌落數(shù)。
3結(jié)果分析
平板上有菌生長，表明被檢樣液中有殘存活菌，若每個平板菌落數(shù)在10個以下，仍可用于消毒，若每個平板菌落數(shù)超過10個，說明每毫升被檢樣液含菌量已超過100個，即不宜在用于消毒。
該公式是一個經(jīng)驗公式.它的理論模式依據(jù)是:100CM2的面積上10MIN降落的菌落數(shù),
等于1升空氣中所含的細菌總數(shù).系數(shù)50000基于上述假說和單位換算而來.
細菌總數(shù)(CFU/M3)=5/10T*100/A*1000*N=50000*N/AT
    5/10T:實際放置了5MIN;
    100/A:A單一培養(yǎng)皿面積;
    1000:1M3=1000L啊,換算成m3
1、空氣細菌落菌數(shù)單位既然是cfu/m3，那采樣時應(yīng)該還要記錄放置平皿的高度。
2、食品安全管理體系中罐頭行業(yè)有個標(biāo)準(zhǔn)如下：
   落下菌數(shù)      空氣污染程度      評價
   30以下          清潔           安全
   30～50               中等清潔      
   50～70               低等清潔        應(yīng)加注意
   70～100             高度污染        對空氣要進行消毒
   100以上       嚴(yán)重污染        禁止加工